什么是蛋白磷酸化？
蛋白磷酸化是生物体内广泛存在的蛋白翻译后修饰方式，与蛋白质活力和功能的调控密切相关，是细胞骨架调控、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢及肿瘤发生等领域重要的研究内容。
化学发光Western Blot的局限
Western Blot是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法。然而，由于磷酸化与非磷酸化蛋白的分子量差异极小，若使用传统的化学发光方法进行检测，需先使用磷酸化蛋白抗体进行孵育，成像检测后进行剥离，重孵育非磷酸化蛋白抗体。剥离及重孵育步骤不仅耗费更多的时间和试剂，更对蛋白定量产生消极影响（剥离过程可能损失一部分目的蛋白或剥离不完全）。
荧光Western Blot让磷酸化蛋白检测更快更准
荧光Western Blot克服了传统化学发光法的局限，通过使用不同荧光基团（光谱无重叠）标记不同的二抗，可进行不同蛋白的多重检测，无需剥离。基于荧光Western Blot的磷酸化蛋白检测有两大优势：
精简实验，快速高效
下表1显示了化学发光与荧光Western Blot检测流程及耗时对比（详见文末相关实验流程）。由表可见，转印后到上机检测前，传统的化学发光法约需6.5h，而采用荧光法不到3h即可完成，实验耗时缩减了近60%，精简流程，告别低效能！
无需剥离，精准定量
荧光Western Blot由于其多重检测特性，无需剥离和重孵育，即可同时检测磷酸化和非磷酸化蛋白。避免化学发光法剥离过程中造成的蛋白损失或剥离不完全，从而保障蛋白定量的准确性。下图左、右分别为使用化学发光及荧光Western Blot的成像效果，样品图像为Azure C系列多功能分子成像系统拍摄。
NIR近红外荧光检测法，因其印迹膜自发荧光更低、灵敏度更高、信噪比更好，是首选的荧光检测方法。基于成熟的NIR 近红外荧光应用技术，Azure Biosystems继Azure C系列多功能分子成像系统后，升级推出Azure多功能分子成像系统及Sapphire FL激光扫描成像系统，自上市以来备受用户青睐，赋能更卓越实验室成像体验！
— 相关实验流程 —
未处理组和使用IFNα 处理组的Hela 细胞裂解液进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离。使用Azure Transfer Buffer 将蛋白样品转印到PVDF 膜上。将膜剪开，一半用化学发光检测，一半用荧光检测，具体操作如下文所述。
化学发光检测实验流程
转印后，印迹膜用磷酸化-STAT1 抗体进行检测。
1. 印迹膜封闭30min，随后使用4μg 兔抗- 磷酸化-STAT1 抗体孵育1h，使用25mL的Azure Fluorescent Wash Buffer 浸润2次后，再洗膜3次，每次5min。
2. 使用3μg HRP 标记anti- 兔抗体孵育膜1h后， 按照上述方法洗膜，置于10mL化学发光底物孵育2min后， 使用Azure C 系列多功能分子成像系统采集图像。
3. 印迹膜剥离：1. 印迹膜在高纯水中浸润5min；2. 印迹膜置于Azure HRP Stripping Buffer中5min。
4. 剥离后，使用25mL的Azure Fluorescent Wash Buffer漂洗印迹膜，2次快速漂洗后，进行3次（每次5min）漂洗。
5. 印迹膜再次进行30min 封闭， 使用4μg 鼠抗STAT1 抗体孵育1h，使用25mL Azure Fluorescent Wash Buffer 漂洗3 次，每次5min。使用3μg HRP 标记的anti- 鼠抗体孵育1h，然后按照上述方法洗膜，置于10mL化学发光底物中孵育2min后，使用Azure C系列多功能分子成像系统中采集图像。
NIR 近红外荧光检测实验流程
转印后，印迹膜室温封闭10min，使用4μg 兔抗- 磷酸化-STAT1 抗体和4μg鼠抗-STAT1 抗体孵育1h， 使用25mL Azure Fluorescent Wash Buffer 漂洗3次，每次5min。随后使用4μg NIR-800 标记的anti- 兔抗体和4μg NIR700 标记的anti- 鼠抗体孵育1h，按上述漂洗方法漂洗后，使用25ml 的PBS 浸润5min，使用Azure C 系列多功能分子成像系统IR800（绿色）和IR700（红色）通道采集图像。
关注我们，解锁更多Western Blot新技能，放飞科研无限想象！
咨询热线：400-750-7890
Azure Biosystems成立于2013年，总部位于美国加州湾区，是一家致力于生命科学领域先进生物成像系统研发、制造、推广及服务一体的创新型公司。拥有分子成像领域近30年经验的卓越团队，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系统和Sapphire激光扫描成像系统已成为技术领先的特色产品。目前，公司已形成分子凝胶成像、Western Blot、RT-PCR及配套试剂耗材等产品线。
公司成像设备全球装机＞5000台，用户数量＞30000，包括美国最高科研机构NIH、梅约诊所、哈佛大学、中国科学院、清华大学、诺华制药等知名科研院所、医院及生物医药企业等。截至目前，发表文章＞3000篇，发表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等国际著名期刊杂志。
